生物信息學視角分析地衣芽孢桿菌幾丁質酶

摘 要: 目的應用生物信息學的方法預測地衣芽孢桿菌幾丁質酶的結構與功能。方法登陸NCBI數據庫搜索目標酶的氨基酸序列, 用生物信息學軟件ProtParam、SIGNALIP、SWISS-MODEL等預測該酶的理化性質、信號肽及跨膜區、空間結構等。結果該酶是由693個氨基酸組成的蛋白質, 相
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  摘 要: 目的應用生物信息學的方法預測地衣芽孢桿菌幾丁質酶的結構與功能。方法登陸NCBI數據庫搜索目標酶的氨基酸序列, 用生物信息學軟件ProtParam、SIGNALIP、SWISS-MODEL等預測該酶的理化性質、信號肽及跨膜區、空間結構等。結果該酶是由693個氨基酸組成的蛋白質, 相對分子質量為77803.79, 分子式為C3483H5251N937O1059S19, 理論等電點為5.42, 不穩定系數為33.82, 親水性系數為-0.590, 二級結構中α-螺旋、β-折疊、無規則卷曲所占比分別為15.73%、26.55%和57.72%。結論地衣芽孢桿菌幾丁質酶為一種親水性蛋白, 有磷酸化、乙酰化位點, 有信號肽, 可分泌, 可能作為一種胞外因子與其他物質共同作用, 為其進一步研究提供新方向。

  關鍵詞: 幾丁質酶; 生物信息學; 預測;

  地衣芽孢桿菌是一種革蘭氏陽性嗜熱土壤細菌, 可合成抗活性物質來阻礙致病菌增殖[1]。幾丁質是乙酰氨基葡萄糖聚合成的高分子多糖, 大量存在于蝦殼, 蟹殼和諸多節肢動物外殼、低等植物中。幾丁質酶 (Chitinase) 作用于幾丁質中的糖苷鍵, 水解幾丁質產生N-乙酰葡糖胺, 按照催化域特征可將其分為18、19家族, 其中, 18家族幾丁質酶多來自于微生物, 19家族幾丁質酶的分布范圍則較窄;按氨基酸序列可分為5類[2], 其中Ⅰ型和Ⅴ型來自于植物, Ⅱ型來自于真菌, Ⅲ型和Ⅳ型來自于大多數微生物和動物。幾丁質酶是酶解法利用幾丁質的核心, 幾丁質酶可以通過水解細胞壁中的幾丁質來達到生物防治的目的;自然中的幾丁質儲存量頗豐, 幾丁質酶可水解幾丁質來促進自然界碳素循環[3];幾丁質的水解產物N-乙酰葡萄糖胺有多種生理活性, 如抗菌、調節機體免疫、阻止癌細胞增生等, 因而在農業、環境保護、醫藥、食品等諸多領域皆有應用[4]。

  地衣芽孢桿菌可大量地向細胞外分泌幾丁質酶, 但酶的結構與性質還未十分清楚, 本文從生物信息學的角度對地衣芽孢桿菌幾丁質酶進行分析, 以期為其進一步研究與應用提供前提。

  1、 數據

  甘肅省植物源農藥重點實驗室課題組提取并保存的地衣芽孢桿菌基因組數據庫獲取幾丁質酶基因序列 (基因檢索號:NC_006270.3) , 提交NCBI數據庫進行BLAST分析, 得到SefSeq信息, 翻譯產物為chitinase[Bacillus licheniformis] (蛋白檢索號:WP_011197522.1) , 簡稱為BlCHI。

  2、 幾丁質酶的生物信息學分析

  2.1、 蛋白結構特征與進化樹構建

  登陸NCBI官網檢索NC_006270.3, 結構域的預測可用以下網址:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi, 再用BLAST進行序列同源性比對, 用MEGA7.0構建進化樹。

生物信息學視角分析地衣芽孢桿菌幾丁質酶

  2.2、 理化性質預測

  用ProtParam將BlCHI的氨基酸序列進行理化性質分析, 有氨基酸的數量與種類、等電點、分子式等。網址:https://web.expasy.org/prot-param/

  2.3、 蛋白質信號肽與跨膜位點預測

  利用SIGNALIP4.1工具在線預測該幾丁質酶有無信號肽序列及跨膜區。網址:http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/

  2.4、 蛋白質翻譯后修飾位點預測

  登陸網址http://www.dabi.temple.edu/disphos/分析蛋白質的翻譯后修飾位點, 乙酰化位點可用NetNGlyc1.0Server工具進行預測。

  2.5、 蛋白結構預測

  將Bl CHI的氨基酸序列輸入GOR4網站中, 可獲得Bl CHI的二級結構組成, 再登陸SWISS-MOD-EL網站 (https://www.swissmodel.expasy.org/) , 對其進行三級結構同源建模。

  2.6、 互作蛋白分析

  用STRING進行在線分析, 獲得BlCHI與其相互作用蛋白的關系圖。網址:https://string-db.org/cgi/input.pl

  3、 結果

  3.1、 蛋白結構特征與分子進化分析

  根據NCBI蛋白保守結構域預測, BlCHI屬于Glyco_hydro_18superfamily即18家族幾丁質酶, 18家族幾丁質酶又可分為3個亞族[5]。按氨基酸序列分, BlCHI屬于Ⅲ型幾丁質酶。其氨基酸C端有一個催化功能區, 是結合幾丁質的區域;氨基酸序列中有一段保守區, 該蛋白有可能參與乙酰基的轉移[6]。

  幾丁質酶普遍存在于芽孢桿菌各菌株中。用BLAST進行同源分析后用MEGA7.0構建系統進化樹 (圖1) 。從進化角度分析, BlCHI與chitinase[Bacillus haynesii]海內氏芽孢桿菌幾丁質酶的同源性最高 (96.54%) , 其次是chitinase[Bacillus paralicheniformis]副水楊芽孢桿菌幾丁質酶。

  圖1 Bl CHI的系統進化樹
圖1 Bl CHI的系統進化樹

  3.2 、幾丁質酶的理化性質分析

  利用ExpasyPortParam軟件進行分析, BlCHI由C、H、N、O、S五種元素構成, 分子中總原子數目為10749, 分子式為C3483H5251N937O1059S19, 理論分子質量單位為77803.79, pI值為5.42。該酶蛋白中的總氨基酸個數為693, 天冬氨酸、丙氨酸和亮氨酸的含量最高, 占氨基酸總量的7.5%、10.1%、6.9%, 帶負電荷的氨基酸 (天冬氨酸與谷氨酸) 總數為94個, 帶正電荷的氨基酸 (賴氨酸與精氨酸) 總數為73個;其不穩定系數為33.82 (系數的劃分點是40.0) [7], 則可以判定為穩定蛋白;其脂肪族氨基酸指數為69.83。

  圖2 Bl CHI的Expasy疏水性分析
圖2 Bl CHI的Expasy疏水性分析

  用Expasy工具對BlCHI進行親疏水性分析, 該蛋白的親水系數為-0.590, 根據蛋白質親、疏水性得分判定[8]可認為該蛋白質為親水性蛋白。其212位亮氨酸 (V) 處疏水性最大, 為3.36, 此處疏水性最強;247和421位丙氨酸 (N) 和組氨酸 (H) 的疏水性最小, 為-3.52, 此處親水性最強。根據疏水性分析圖, 可以知道該蛋白中有許多親、疏水性區域, 但分布聚集度不高, 疏水性系數的變化范圍較大, 波動明顯。

  3.3、 蛋白質信號肽、跨膜區及修飾位點分析

  利用軟件SignalP-4.1對BlCHI有無信號肽進行預測, C值表示剪切位點值、S值表示信號肽區域值、Y值表示剪切位點校準值。由圖3可知該蛋白的S值區間為1~27位氨基酸, C值與Y值最大值均在第27位谷氨酸 (E) 。因此推斷BlCHI含有信號肽, 可推測BlCHI為分泌蛋白。用TMHMM軟件分析預測BlCHI的跨膜區進行預測, Inside表示胞內區、Outside表示胞外區、Transmembrane表示跨膜區。如圖4, 圖片最上方的紫色線表示氨基酸都位于膜外, 推測BlCHI無跨膜結構, 不屬于膜蛋白。經NetNGlyc1.0Server分析BlCHI的翻譯后修飾位點, 如圖5, 結果顯示該蛋白有21個磷酸化位點, 分別是11個酪氨酸、8個絲氨酸、2個蘇氨酸。且在385位段的NVTG處極可能有糖基化修飾。

  圖3 Bl CHI的信號肽序列分析
圖3 Bl CHI的信號肽序列分析

  圖4 Bl CHI的跨膜結構區分析
圖4 Bl CHI的跨膜結構區分析

  圖5 Bl CHI的翻譯后磷酸化修飾位點分析
圖5 Bl CHI的翻譯后磷酸化修飾位點分析

  3.4、 二級結構分析

  用GOR4在線分析BlCHI的二級結構, 如圖6, α-螺旋結構 (TH) 有109個, 占15.73%;β-折疊 (EE) 結構有184個, 占26.55%;無規則卷曲結構 (CC) 有400個, 占57.72%。其中無規則卷曲占了很大比重, 在這部分結構中很有可能存在多個活性中心, 利于提高BlCHI的催化效率。

  圖6 Bl CHI的二級結構分析
圖6 Bl CHI的二級結構分析

  注:圖中的藍色線表示TH結構, 紅色線表示EE結構, 紫色線表示CC結構

  3.5、 三級結構分析

  用SWISS-MOLGEL在線對BlCHI進行三級結構同源模型構建, 構建的三維結構見圖7。SWISS-MOLGEL工具分析結果中有兩個可以評估模型質量的值, 分別是GMQE值與QMEAN值, 其中GMQE值為0-1的一個數, 數值越大說明建立的模型越貼合實際[9];QMAN值用手勢表示模型的好壞。在對BlCHI的同源建模中GMQE值為0.81, 說明該模型的構建與真實結構的契合度非常高, 也與NCBI蛋白三級結構數據庫中的3D結構十分類似, QMEAN手勢向上, 說明所得模型的效果良好。

  圖7 Bl CHI的SWISS-MOLGEL三級結構同源建模
圖7 Bl CHI的SWISS-MOLGEL三級結構同源建模

  3.6、 互作蛋白分析

  登陸STRING網站, 在線分析與BlCHI相互作用的蛋白, 結果表示其互作蛋白有hfq、pepA、arp、ybbD、chbB、chi和comEA, 從圖中可以看出BlCHI即chiA處于核心位置, 與其他蛋白有緊密的協作關系。

  圖8 Bl CHI的STRING互作蛋白分析
圖8 Bl CHI的STRING互作蛋白分析

  4、 討論與展望

  本文運用生物信息學的方法對地衣芽孢桿菌幾丁質酶BlCHI進行了結構與功能的分析, 在系統進化樹中BlCHI表現與海內氏芽孢桿菌、副水楊芽孢桿菌幾丁質酶較高的同源性, BlCHI中含有94個酸性氨基酸73個堿性氨基酸, 酸性氨基酸的比重較大, 使得其理論等電點偏小, 為5.42, 可歸為酸性幾丁質酶類[10]。BlCHI中有信號肽, pepA可能為氨基肽酶, 可以水解蛋白質N端的信號肽, 使蛋白向胞外分泌, STRING蛋白互作分析表明BlCHI與chbB幾丁質結合蛋白關系密切, 研究表明chbB可利于幾丁質酶與底物的結合, 提高其催化效率, chBB可能會在害蟲腸道中表達, 利于BlCHI發揮作用抵制農作物病害, hfq、apr、comEA三種蛋白與BlCHI的活性調節有關, 但機制尚未清楚, 需要更進一步地研究。地衣芽孢桿菌作為一種腸道菌群, 有調節腸道菌群平衡、拮抗致病菌的作用, 地衣芽孢桿菌幾丁質酶可以水解一些病原菌細胞壁從而殺滅病原菌;大量的外泌幾丁質酶有利于幾丁質的酶解法利用, 因此進一步對地衣芽孢桿菌的遺傳改良以大量表達幾丁質酶是十分重要的。

  本文首次對地衣芽孢桿菌幾丁質酶的結構進行了分析, 這將為地衣芽孢桿菌幾丁質酶的克隆表達與定向進化方面的研究提供資料, 為BlCHI的異源表達, 與制備提供了相關依據。

  參考文獻

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    左一萌.地衣芽孢桿菌幾丁質酶的生物信息學分析[J].青海農技推廣,2019(02):52-56. 轉載請注明來源。原文地址:http://www.rubcby.tw/html/zhlw/20190616/8177847.html   

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